2019年，病毒兇猛，短時間重創全球。病毒COVID-19通過刺突蛋白S蛋白S1亞基的受體結合位點（RBD）與受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）的結合介導進入細胞內部。針對這些，各國相繼加入疫苗的研制。
2020年，60多個候選疫苗批準進入臨床試驗,其中mRNA核酸疫苗等疫苗獲批緊急使用或附條件上市。與傳統疫苗相比,mRNA疫苗有很多優勢,如制備安全、高效及質量可靠。脂質遞送技術應用于mRNA疫苗，mRNA疫苗只是脂質包裹的一段mRNA分子，其中的mRNA分子進入人體后只是把攜帶的抗原信息傳遞出去，表達出抗原棘突蛋白。
現在全球已經有多家企業正在進行mRNA疫苗的研發。脂質遞送技術也將獲得更快發展。下面我們將對mRNA的研制難點，制備工藝及主要輔料等作一個簡要的介紹。
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mRNA**疫苗研制的主要難點
mRNA疫苗的研制面臨三個主要難點:
1.1.mRNA非常脆弱，特別不穩定，非常容易降解。日常環境和身體中有很多酶能夠迅速將它們降解。mRNA的不穩定對于藥物遞送是困難的。
1.2.mRNA在體內的有效靶向遞送。
1.3.mRNA鏈是一個帶有負電荷的長鏈大分子。在人體的細胞表面有一層也帶有負電荷的細胞膜， mRNA很難穿過細胞膜達到細胞內部。
上述三個難點，脂質遞送技術均能有效解決。脂質遞送技術可以保護mRNA，防止降解，幫助它們進入人體細胞，有效靶向遞送，協助它們指導細胞生成病毒蛋白?？梢哉f沒有脂質遞送技術，就沒有mRNA疫苗。
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脂質遞送技術簡介
截至目前，脂質載體已成為遞送 mRNA 為有效的非病毒載體。用于遞送 mRNA 的脂質載體主要包括陽離子脂質體復合物 (lipoplex，LP)、脂質體聚合物(lipopolyplex，LPR)、脂質體納米粒(lipid nanoparticle，LNP) 、納米結構脂質載體(NLC)等，其中以脂質體納米粒LNP應用的*為**。對于脂質體遞送 mRNA 來說，不同的給藥途徑對誘導蛋白表達、給藥頻率及副作用強度具有重要影響。如 LNP 遞送可通過改變給藥途徑來改變 mRNA 體內表達量和持續時間，其中肌注和皮內注射顯示出比靜脈注射更持久的蛋白表達。有文獻報道mRNA-LNP 的外殼是單層的，但也有學者提出mRNA-LNPs 的外殼由一個或多個雙層組成，可見目前的技術評估mRNA-LNP 殼的性質是困難的，可能存在多種類型的mRNA-LNP 結構，這取決于脂質的性質和mRNA-LNP 的制備方法。脂質體納米粒 LNP外殼由不同的脂質組成，每種脂質都發揮著不同的功能，LNP表面主要是中性脂質和PEG化脂質以及部分可電離的陽離子脂質和膽固醇。在**內部，存在可電離的陽離子脂質、膽固醇（取決于其濃度）、水和 mRNA 的主要部分。
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脂質遞送技術在mRNA疫苗中的應用
mRNA 疫苗中，mRNA（信使核糖核酸）被包裹在脂質遞送技術中，其為 mRNA 提供保護，并將其安全遞送至人體細胞，使其在細胞中釋放，使疫苗起效。通過非共價親和力和細胞膜結合和內吞被攝取，進入細胞后 mRNA 逃離內吞小泡，被釋放到細胞質中表達靶蛋白， BioNTech等均采用LNP技術。脂質遞送也叫脂質體包埋，相當于一個基因療法的變體，這個技術輝瑞疫苗包埋的完整性**只有75%，必須用**溫冷藏。
LNP技術平臺的其中一個關鍵輔料是可離子化的脂質。脂質傳遞系統的可離子化脂質的極性隨著pH值的變化會改變，在低pH值的環境中，它攜帶正電荷，這讓它們可以與mRNA形成復合體，起到穩定mRNA的作用。在生理pH值時，是中性，減少了它的毒副作用。在脂質傳遞系統的**，還包裹著聚乙二醇修飾的脂質分子（PEGylated lipid），聚乙二醇（PEG）的修飾，它防止脂質體聚集在一起，控制脂質體顆粒的大小，可起到防止脂質體被人體的免疫系統發現的作用。脂質傳遞系統中還包含膽固醇和其它輔助脂質分子，協助構成脂質傳遞的完整結構。脂質傳遞系統在碰到細胞膜時會被細胞吞入到細胞內形成稱為內體（endosome）的囊泡。在細胞內部，內體的pH值會降低，導致可離子化的脂質分子攜帶正電荷，改變脂質傳遞系統的構象，促使mRNA從內體中解脫出來，與負責生產蛋白的核糖體結合，指導病毒蛋白的合成了。
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mRNA疫苗的制備工藝
基于 mRNA 疫苗的研發，脂質遞送技術已經被證實是用來遞送 RNA 藥物、疫苗的有效載**式。LNP含有多種成分，如何精確控制其組分、粒度、流量、形態等參數，同時還能確保質量，加快生產，這可能是 mRNA 疫苗生產**的難點。傳統的脂質體生產方法，比如乙醇注入法、T型混合法、薄膜分散法、逆向蒸發法、化學梯度法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法等，但是這些方法收率低，包封率低，難以用于大批量生產。有文獻報道采用沖擊式射流混合法可以實現大生產，利用 BlueShadow 80P 高壓泵，讓疫苗和脂質溶液形成兩股射流，在腔體中進行對沖，利用流體動力學讓脂質各個組分充分地混合，形成包裹mRNA的納米脂質體顆粒。生產設備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間（C級）內。通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內，以適應藥品生產中的 CIP清潔程序。該系統包括：KNAUER 碰撞噴射混合器（IJM)， 脂質/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路，脂質體出口管路，CIP在線清潔系統和不銹鋼框架。
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mRNA疫苗關鍵輔料
mRNA疫苗其輔料中的關鍵成分為構成LNP的脂質材料，其中包括陽離子脂質體，PEG化脂質體等，解決了mRNA大分子、不穩定、易降解的困難，并實現了mRNA有效地胞內遞送。大部分脂質材料以進口為主，國內只有少量品種生產， 其中AVT 公司為國內主流脂質代理商。AVT 累計已經有多個在脂質體制劑中有所應用的磷脂類輔料在CDE獲得了公示，DMG-PEG2000，膽固醇（供注射用），DLin-MC3-DMA，蔗糖（供注射用），海藻糖Hipo-S （供注射用），DSPE-MPEG2000（藥用注射級）等脂質體遞送關鍵輔料都有供應。目前 mRNA 疫苗的結構具有有不同的分子和配比結構，但輔料基本相同，主要包括以下幾種：
5.1.陽離子脂質：與帶負電的 mRNA 結合，可高效包載核酸藥物，同時提供正電荷，與帶負電荷的mRNA復合，有助于內涵體逃逸，mRNA體內轉染，可離子化脂質具有pH敏感性。
5.2.膽固醇：穩定LNP結構；調節膜流動性，提高粒子穩定性。
5.3.輔助型脂質：常用DOPE，穩定粒子，破壞內涵體體穩定性，提高核酸遞送效率
5.4.聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，提高粒子穩定性。減少粒子在體內與血漿蛋白的結合，延長體循環時間。
5.5.蔗糖，供注射用，提高LNP穩定性和mRNA疫苗的穩定性，防止脂質黏性過大。
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mRNA疫苗脂質遞送技術生產實例
mRNA疫苗非活性成分：
一：LNP技術，膜骨架DSPC,陽離子脂質ALC-0315,PEG化脂質ALC-0159,膽固醇；蔗糖；鹽類，氯化jia，氯化鈉，磷酸二qin鉀，二水合磷酸氫二鈉。
二：LNP技術，膜骨架DSPC,陽離子脂質SM-102,PEG化脂質PEG2000-DMG,膽固醇；蔗糖；緩沖鹽類，氨丁三醇，氨丁三醇鹽酸鹽，醋酸，醋酸鈉。
輝瑞-BioNTech疫苗工藝過程：
原液制備：疫苗復雜生產一般從開始到結束為60天，其中30天用于測試。每月生產2-3億支。細菌培養產生稱為質粒的DNA環，其中包含冠狀病毒基因。從主細胞庫中提取質粒瓶，融化。經改造的大腸桿菌，將質粒帶入細胞內。改造過的細菌被移至生長培養基中，然后在營養肉湯中發酵，每20分鐘繁殖一次，并復制出需要的DNA質粒?；瘜W法分解細菌，并從其封閉的細胞中釋放出質粒。將質粒與先前的樣品進行比較，確認冠狀病毒基因序列沒有改變，用酶切割并過濾，將純化的DNA留在一升的瓶子中。每瓶將產生約150萬劑。每個DNA瓶都被冷凍，使用酶將DNA轉錄成信使RNA或mRNA。測試所得的16升袋裝的mRNA，將其冷凍。
脂質遞送技術包裹：油性脂質體來保護mRNA并幫助其進入人體細胞。脂質體和mRNA的裸鏈通過碰撞噴射混合在一起，電荷將它們急速混合在一起，形成脂質體疫苗顆粒。
分裝冷凍：每分鐘575個小瓶的速度分裝。疫苗冷藏為低溫，但在裝瓶過程中會快速升溫，如果不在冷凍中的時間過長，mRNA將會變質。必須在短于46小時的時間將液態疫苗分裝到小瓶中，馬上進行深度冷凍。每195個裝滿的小瓶放置到一個小塑料托盤中，然后冷凍。
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疫苗脂質遞送技術的展望
目前，****依然蔓延，mRNA疫苗也將發揮更大的作用。作為重要的載體脂質遞送技術也將獲得更多關注，其制備工藝、制備材料及表面修飾等方面也會取得了較大的進展。據報導歐洲有工廠已投巨資進行擴產疫苗用特殊脂質。國內目前全球共有 15款mRNA 疫苗在研，其中CuerVac、Moderna、BioNTech被稱為“mRNA國際三*"。 在國內，多家本土公司也在開發mRNA疫苗中，據了解，國內已有 8 家研發型 mRNA 疫苗企業，有3家已經處于臨床階段了。國內脂質類輔料需求量將暴增，能促進脂質遞送技術的發展，加快相關大生產工藝設備的研制，促進脂質遞送關鍵輔料的國產化。
參考資料：
1.Without these lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. Retrieved April 27, 2021,
2. Let’s talk about lipid nanoparticles. Retrieved April 27, 2021
3.Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics,
